4D細(xì)胞牽引力顯微鏡，三維矩陣和細(xì)胞形態(tài)牽引力重建評估系統(tǒng)

細(xì)胞行為至關(guān)重要的周圍微環(huán)境的3D生理學(xué)相關(guān)維度與時(shí)間依賴的動態(tài)活動信息

4D牽引力量化分析系統(tǒng)背景及重要性：

三維 (3D) 結(jié)構(gòu)內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞行為比在二維 (2D) 培養(yǎng)的細(xì)胞行為更能反映它們的體內(nèi)本質(zhì)。

目前對細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的理解主要基于對平面二維 (2D) 組織培養(yǎng)基質(zhì)上的粘著斑和其他粘附結(jié)構(gòu)的體外研究，

然而，3D 生理學(xué)相關(guān)性更高的與更能體現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞本質(zhì)的三維 (3D) 環(huán)境中的細(xì)胞行為已顯示出顯著差異，一個關(guān)鍵的組成部分是細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)，

它通過細(xì)胞-基質(zhì)相互作用為駐留細(xì)胞提供生物物理和生化線索。人們普遍認(rèn)為，除了化學(xué)信號外，機(jī)械特性和信號在許多生理和病理過程中也起著至關(guān)重要的作用，

包括發(fā)育、生長、再生和癌癥轉(zhuǎn)移等疾病狀態(tài)。因此，3D 環(huán)境中細(xì)胞-基質(zhì)機(jī)械相互作用的量化對于增強(qiáng)我們目前對這些過程的理解為重要，為了推進(jìn)目前對細(xì)胞基質(zhì)

力學(xué)的理解及其對生物材料開發(fā)的重要性，的三維(3D) 測量技術(shù)是必要的。

法國的4D細(xì)胞牽引力量化分析系統(tǒng)是一套應(yīng)用一種新穎的 3D 培養(yǎng)概念來量化評估細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，為研究生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，

結(jié)合了體內(nèi)微環(huán)境的盡可能多的特征，適用于3D生理學(xué)相關(guān)性更高的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞可以完嵌入水凝膠中，并結(jié)合時(shí)間依賴性(4D)獲取細(xì)胞更多動態(tài)信息，

該系統(tǒng)是公認(rèn)的一站式 4D（3D+時(shí)間）牽引力準(zhǔn)確、快速量化分析系統(tǒng)，是真實(shí)三維矩陣和細(xì)胞形態(tài)的牽引力重建評估模型。

該系統(tǒng)將復(fù)雜的方法結(jié)合到一個封閉且用戶友好的軟件中，該軟件不需要代碼操作即可在生物學(xué)研究中應(yīng)用 4D TFM，這對機(jī)械生物學(xué)具有很強(qiáng)的前景。

特點(diǎn)：

實(shí)驗(yàn)人員可以輸入原始顯微鏡圖像，并通過交互式圖形用戶界面跟蹤每個計(jì)算步驟以進(jìn)行參數(shù)調(diào)整。可以選擇不同的圖像濾波器來處理各種類型的數(shù)據(jù)，并使用自由形式變形(FFD)算法進(jìn)行位移測量。并已用于涉及單細(xì)胞和多細(xì)胞系統(tǒng)中 2D、3D 和 4D（延時(shí)）測量的各種實(shí)驗(yàn)研究中。 基于物理的非線性逆方法 (PBNIM) 提供了準(zhǔn)確且計(jì)算效率高的力計(jì)算。該系統(tǒng) 將復(fù)雜的方法結(jié)合到一個封閉且用戶友好的軟件中，該軟件不需要代碼操作，并允許在生物學(xué)研究中應(yīng)用 4D TFM，這對機(jī)械生物學(xué)具有很強(qiáng)的前景。

1、面體現(xiàn)細(xì)胞時(shí)（時(shí)間相關(guān)的活體動態(tài)信息）空（3D）本質(zhì)的牽引力量化分析模型：

該系統(tǒng)結(jié)合使用相當(dāng)于牽引力顯微鏡 (TFM) 的 3D 位移顯微鏡和活細(xì)胞流變學(xué)，描繪了位移傳播和基質(zhì)硬化的特征時(shí)間和長度尺度，

在3D基礎(chǔ)上獲取更多動態(tài)相關(guān)信息，這是理解細(xì)胞-基質(zhì)機(jī)械相互作用的關(guān)鍵信息和下一代仿生材料的合理設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。

可以進(jìn)行真實(shí)的三維矩陣和細(xì)胞形態(tài)的牽引力重建評估。

2、無需基準(zhǔn)標(biāo)記即可對膠原中大細(xì)胞產(chǎn)生的變形進(jìn)行3D場量化的技術(shù)

應(yīng)用基于非剛性自由形式變形（FFD）的圖像配準(zhǔn)來計(jì)算MRC-5人肺成纖維等細(xì)胞在I型膠原水凝膠中誘導(dǎo)的場位移，僅依靠膠原原纖維的二次諧波生成（SHG），

基于二次諧波生成（SHG）的纖維成像可以避免使用基準(zhǔn)標(biāo)記只能測量位移幅度和應(yīng)變通常分別為幾微米和小于10%的數(shù)量級的相對較小的變形限制,可用于在原纖維生物材料

（如膠原蛋白）中施加牽引的細(xì)胞可能會產(chǎn)生大而復(fù)雜的變形場，可以從原纖維和熒光珠中得出可比較的位移場。

這些算法允許捕捉大的材料變形，同時(shí)通過將從粗到細(xì)的方法與迭代圖像扭曲過程相結(jié)合來顯著提高計(jì)算出的位移的空間分辨率。

基于FFD的圖像配準(zhǔn)，結(jié)合無標(biāo)記的二次諧波生成（SHG）成像，能夠準(zhǔn)確計(jì)算大變形（此處定義為大于10%的應(yīng)變幅度）下原纖維膠原中細(xì)胞誘導(dǎo)的場位移。

I型膠原原纖維的SHG信號具有產(chǎn)生高對比度和亞微米分辨率圖像的優(yōu)點(diǎn)。

新穎的方法將非剛性圖像配準(zhǔn)與無標(biāo)記 SHG 成像相結(jié)合，能夠恢復(fù)由纖維環(huán)境中的細(xì)胞引起的復(fù)雜和大的變形。 這是一種簡單的技術(shù)，不需要傳統(tǒng)使用的熒光珠，

但也有它們的所有缺點(diǎn)。 與基于珠子的成像的比較揭示了基于原纖維和基于珠子的位移場之間的良好定性和定量對應(yīng)。 恢復(fù)能力。

允許在大位移（大約 10 μm）和應(yīng)變狀態(tài)（高達(dá) 40%）下測量 3D 場變形。 對于研究大細(xì)胞誘導(dǎo)的變形作為細(xì)胞-生物材料相互作用和細(xì)胞介導(dǎo)的生物材料

重塑的固有組成部分具有很大的前景。

3、的計(jì)算機(jī)驗(yàn)證框架，適用于任何 3D TFM 實(shí)驗(yàn)設(shè)置，可用于正確耦合 3D TFM 的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方面

√基于物理的三維非線性逆方法提高牽引力顯微鏡的分辨率

√通過基于物理的逆方法提高 3D 牽引力顯微鏡的準(zhǔn)確性

√用于 3D 牽引力顯微鏡的準(zhǔn)確、高效且易于訪問的軟件工具

√應(yīng)用于體外血管疾病模型的新穎易用的 3D 牽引力顯微鏡

√牽引力顯微鏡框架下基于三維非線性物理約束小化的反演方法

√的 3D 牽引力顯微鏡可計(jì)算新血管生成中的力

√驅(qū)動增強(qiáng)了人類神經(jīng)管類器官的模式化

4、可以處理不同的3D TFM 方法：基于珠子的 TFM和基于纖維的 TFM（具有纖維網(wǎng)絡(luò)）

將細(xì)胞嵌入具有高度可調(diào)特性的合成材料3D 環(huán)境中，如聚乙二醇 (PEG) 以及更接近生理?xiàng)l件的天然材料，如膠原蛋白

或纖維蛋白水凝膠。使用高度仿生的合成纖維水凝膠來研究和定制雙向細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。面了解細(xì)胞牽引、纖維

重塑、基質(zhì)特性和細(xì)胞行為如何相互作用。在細(xì)胞長度尺度上完整繪制細(xì)胞-基質(zhì)相互作用圖，為合理設(shè)計(jì)更好的仿生

材料提供了不可或缺的信息

用途廣泛：

可以處理不同的 3D TFM 方法，基于珠子的 TFM與基于纖維的 TFM此外，用戶可以運(yùn)行經(jīng)典的 TFM 問題（使用應(yīng)力圖像和松弛圖像 ) 

或延時(shí) TFM (使用一系列應(yīng)力圖像和一個松弛圖像)。如果研究人員的實(shí)驗(yàn)方案不包括細(xì)胞成像，基于基準(zhǔn)標(biāo)記的位移計(jì)算仍然是可能的，

典型創(chuàng)新應(yīng)用：

√通過量化血管生成芽周圍的基質(zhì)變形和細(xì)胞力來篩選和工程化細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境

√研究人多能干細(xì)胞衍生類器官內(nèi)在和外在機(jī)械力之間的機(jī)械傳導(dǎo)反饋

√研究體外血管生成芽的牽引誘導(dǎo)基質(zhì)位移

√量化血管生成芽周圍的細(xì)胞外基質(zhì)變形和細(xì)胞力

√3D 多細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞機(jī)械環(huán)境的定量成像

√在 3D 體外血管生成中獲取細(xì)胞機(jī)械信息的計(jì)算工具

√膠原蛋白中內(nèi)皮芽的肌動球蛋白依賴性入侵